Lors d’une purification, faire varier le pourcentage de solvant fort permet une élution plus rapide des produits, mais cela peut aussi desservir en créant une co-élution des composés si la proportion de solvant organique varie trop rapidement. On peut alors tester différents types de gradients parmi les trois modes existant en chromatographie :
- Isocratique
- Linaire
- Par palier
Lequel choisir ? Lequel permettra la meilleure séparation des produits ?
Nous avons réalisé la purification de 5 différents peptides selon 2 protocoles, le premier en gradient linéaire, et le second par palier afin de déterminer lequel est le plus adapté.
Le mélange de composés est le suivant :
1 – GLY-TYR (MW 238)
2 – VAL-TYR-VAL (MW 380)
3 – Met-Enkephalin (MW 574)
4 – Angiotensin (MW ~1 000)
5 – Cytochrome C from bovine heart (MW 11 749)
1) Méthode : Gradient linéaire
Colonne : PT-15C18N-F0025
Solvant A : Eau + 0.1%TFA
Solvant B : ACN + 0.1%TFA
Elution
| Tps | %A | %B |
| 0 | 95 | 5 |
| 45 : 00 | 60 | 40 |
Débit : 15 mL/min
Quantité injectée : 150 µL (soit 1.8 mg de chaque peptide)
Le résultat est le suivant :
En mode phase inverse, les peptides (MW>3000Da) restent sur le support C18 tant qu’un certain pourcentage de solvant organique n’est pas atteint. Nous nous servirons donc du résultat de la première méthode pour définir le pourcentage de solvant pour purifier chaque composé un à un. Ainsi, nous voyons donc facilement que les produits sortent respectivement aux conditions suivantes :
90/10
84/16
80/20
75/25
65/35
Nous mettons donc en œuvre une seconde méthode par palier cette fois.
2) Méthode : Gradient par palier (step gradient)
Colonne : PT-15C18N-F0025
Solvant A : Eau + 0.1%TFA
Solvant B : ACN + 0.1%TFA
Elution
| Tps | %A | %B |
| 0 | 90 | 10 |
| 5 : 57 | 90 | 10 |
| 6 : 00 | 84 | 16 |
| 14 : 57 | 84 | 16 |
| 15 : 00 | 80 | 20 |
| 23 : 57 | 80 | 20 |
| 24 : 00 | 75 | 25 |
| 30 : 57 | 75 | 25 |
| 31 : 00 | 65 | 35 |
| 40 : 00 | 65 | 35 |
Débit : 15 mL/min
Quantité injecté : 150 µL (soit 1.8 mg de chaque peptide)
Le résultat est le suivant :
Les différences sont rapidement visibles :
– temps de méthode plus court (bien qu’il soit encore possible de réduire)
– pics plus intenses.
– nous arrivons à séparer une impureté du Cytochrome C.
Par conséquent, avec un tel profil, il est même possible d’injecter plus de produit, et donc de gagner en productivité.
Etant donné que le dernier composé est élué avec une proportion assez grande de solvant organique, il ne parait pas utile de tenter une méthode isocratique qui se soldera par une co-élution de tous les composés.
Conclusion
Les deux méthodes fonctionnent. Il s’agit de trouver le bon compromis en fonction de l’objectif de l’utilisateur :
– moins de temps de recherche pour le mode linéaire
– moins de temps de run et meilleure séparation pour le mode par palier
En conclusion, dans un souci d’optimisation on peut développer la méthode en effectuant en premier lieu un léger gradient linéaire (augmenter de 1%/min) afin de trouver les proportions de solvant fort éluant les produits, puis passer en mode step en adaptant le temps de chaque étape. De cette manière, il est alors possible d’augmenter la charge de produit tout en diminuant le temps de méthode et la consommation de solvant.
